BALB/c тышқандарын иммундеудің бірінші күні құрсақ ішіне әрбір антигенді 100 мкг мөлшерде, Фрейндтің толымсыз адъювантымен (Gibco, США) тең мөлшерде араластырылып енгізілді. Иммундеудің 7,11, 12, 13 – ші күндері тышқандарға pH 7,2 – 7,4 болатын буферленген физиологиялық ерітіндіде араластыру арқылы 100 мкг антигенді енгіздік. Cоңғы иммундеуден үш күн өткен соң тышқандардың қан сарысуындағы телімді антиденелердің титрлері қатты фазалы иммунды ферментті талдау тәсілімен анықталды.Кесте 1.

Кесте 1 – Иммунды ферменттік талдаудың жанама тәсілімен BALB/c тышқандарының қан сарысуында түзілген антиденелер титрін зерттеу нәтижесі

Тышқандар топтары	Иммундеуде қолданылған антигендер	Телімді антиденелер титрі
		Mycobacterium tuberculosis УДД	Mycobacterium tuberculosis ЛПС
I	M. tuberculosis УДД	1:25600	1:100
II	M. tuberculosis ЛПС	1:400	1:12800
Ескерту: УДД – ультрадыбысты дезинтеграт ЛПС — липополисахарид

1 – ші кестеден көргеніміздей, ұқсас антигенге қарсы Mycobacterium tuberculosis УДД – пен иммунделген тышқандардың қан сарысуындағы телімді антиденелер титрі ИФТ – да 1:25600- ге жетті. ЛПС – пен иммунделген тышқандардың қан сарысуындағы антиденелер өз антигенімен 1: 12800 титрде байланысқа түсті. Жоғарыдағы антигендерге қарсы пайда болған антиденелер арасындағы әлсіз қиылысқан реакцияның байқалуы қолданылған препараттар детерминанттарының арасындағы айтарлықтай айырмашылықтың бар екендігін дәлелдейді.

Сонымен, біз колданған Мусоbасtеrіит tиbесиlоsis УДД антигені мен Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің липополисахаридімен ВАІВ/с тышкандарын иммундеу сызбасы, қолданылған антигенге қарсы антиденелердің жеткілікті мелшерде ілуіне мүмкіндік беріп, тәжірибедегі жануарлар организмнің иммунды жүйесін күшейтуге толығымен жарамды болды. Бұл спецификалық антнденелерді өндіретін В-лимфоциттер клондарының белсенді индукциясын көрсетеді.

Тышкандардың әрбір антиденелер титрі тобынан максималды болған жануарлар таңдалып алынды, олардың көк бауырлары иммунды лимфоциттердің көзі ретінде колданылды. Тышкандардың лимфоциттерін Х63- Аg 8.6.5.3 линиялы миеломды жасушалармен гибридизациялауды ПЭГ-4000 қатысуымен жүргіздік.

Гибридомалардың телімді антиденелерді өндіретіндігін өскен ортаның аздап сарғаюы байқалганда және гибридом жасушалары ұяшық беткейі көлемінің 30%-ын алғанда тестілеуді бастайды.

Иммунды спленоциттер мен миелома жасушаларын будандастыру нәтижелері 2-ші кестеде көрсетілген

Кесте 2 — Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің ультрадыбысты дезингегратымен егілген ВАІВ/с тышкандардың лимфоциттері мен миелома жасушаларын будандастыру нәтижелері

Будандастыру реті	Иммунеуде қолданрылған антигендер	Миелеломды жасуша мен спленоциттердің қатынасы	Жасушалар себілген шұңқыршарлар саны	Гибридті жасушалары бар шұңқыршарлар
				саны	%
1	M. tuberculosis УДД	1:10	384	90	23,4
2	M. tuberculosis ЛПС	1:10	384	60	15.6
Ескерту: УДД – ультрадыбысты дезинтеграт ЛПС — липополисахарид

2-ші кестеден көргеніміздей, будандастырудың нәтижесінде М. tиbеrсиlоsіs-тің ультрадыбысты дезинтеграты ақуызды антигенімен иммунделген тышқандардың спленоциттері мен миелома жасушаларының гибридизациялау кезінде жақсы көрсеткіш байкалып отыр. Гибридомалардың өсуі 384 себілген барлык ұяшықтың 90-ында байкалды, яғни жасушалардың будандасуы 23,4% кұрады. Липополисахаридті антигенімен иммунделген жануарлар лимфоциттерін колданған жағдайда бұл көрсетіш 60-қа немесе 15,6 %-ға тең болды.

Жасуша гибридизациясының біз кол жеткізген жоғары дәрежесі ИФТ-да телімді антиденелерді түзуші гибридті клондарды анықтау жұмыстарын бастауға мүмкіндік берді. Гибридомалардың спецификалык антиденелер өндіруін тестілеу тышқандарды иммундеуге қолданылған микобактериалды антигендер көмегімен жүргізілді (3-кесте).

Кесте 3 — Гибридомалардың өсінді сұйықтығын ИФТ-да тестілеу нәтижелері

Антигендер	Түзілген гибридомалардың саны	Антигендерге телімді антиденелерді түзетін клондар
		саны	(%)
M. tuberculosis УДД	90	15	16,6
M. tuberculosis ЛПС	60	10	16,4
Ескерту: УДД – ультрадыбысты дезинтеграт ЛПС — липополисахарид

3-ші кесте көрсеткіштері бойынша будандастыру нәтижесінде пайда болған 90 гибридоманың 15-і ультрадыбысты дезинтегратының ақуызды антигендеріне телімді антиденелерді синтездейтіндігі байқалса, М. tuberculosis-тің ЛПС антигенімен иммунделген тышкандардың лимфоциттері мен миеломаларын будандастыру нәтижесінде пайда болған 60 гибридті жасушалардың небары 10-нан немесе 16,4%-нан ғана аталмыш антигенге телімді антиденелер анықталып отыр.

Моноклоналды антиденелерді тұрақты синтездейтін клондарды іріктеу мақсатында алынған гибридомалардың белсенділігі иммунды ферментті талдау көмегімен арасына 3-4 күн сала отырып бес рет тексерілді (4-кесте).

Кесте 4 — Гибридті жасушаның скрининг нәтижелері

№	Гибридомалардың атауы	Гибридті жасушалардың антиденелік белсенділігі
		1	2	3	4	5
Mycobacterium tuberculosis УДД
1	1Д6	1:4	1:4	1:8	1:16	1:32
2	1F9	1:8	1:8	1:16	1:16	1:32
3	1G3	1:16	1:32	1:32	1:64	1:64
4	3Д6	1:4	1:8	1:8	1:16	1:16
5	1Д7	1:8	1:16	1:16	1:32	1:64
6	2G10	1:2	1:2	1:4	1:4	1:8
7	3Д9	1:2	1:4	1:4	1:4	1:8
8	2G5	1:8	1:8	1:8	1:8	1:16
9	2E6	1:4	1:4	1:4	1:8	1:16
10	2C10	1:16	1:16	1:32	1:64	1:32
11	3B4	1:8	1:8	1:16	1:16	1:32
12	3C5	1:4	1:4	1:2	1:8	1:16
13	1C8	1:4	1:8	1:8	1:16	1:32
14	1Д10	1:4	1:4	1:8	1:16	1:32
15	2B7	1:4	1:4	1:8	1:16	1:32
16	1C2	1:4	1:2	1:2	1:2	-
17	1B3	1:4	1:2	1:2	1:2	-
18	2Д3	1:4	1:4	1:4	1:2	-
19	2E10	1:4	1:2	1:2	1:2	-
20	3B8	1:4	1:4	1:4	1:4	-
21	2G7	1:8	1:4	1:4	1:2	-
22	3F5	1:16	1:16	1:8	1:2	-
23	1B9	1:4	1:4	1:2	1:2	-
24	1F7	1:4	1:2	1:2	1:2	-
25	2G9	1:8	1:8	1:4	1:2	-

4-ші кесте мәліметтері бойынша М tиbегсиlоsіs-тін УДД антигеніне телімді антиденелерді түзетін 15 гибридомалардың барлықтары бес рет тексеру барысында да өз белсенділіктерін сактағандығы айқындалды, 15 гибридома ішінен 1G3, 1Д7 және 2С10 деп аталатын гибридті клондардың синтездейтін антиденелерінің титрі 1:64 болса, қалғандарының түзетін антиденелер титрі 1:64 бен 1:32 шамаларында болды.

     М. tuberculosis-тің ЛПС антигенге қарсы антиденелерді түзетін гибридомалардың барлығын төрт рет тестілеу нәтижесінде 1:2 мен 1:16 аралығындағы титрлерді көрсетсе, бесінші рет тексеру барысында өздерінің антиденелік белсенділіктерін тұтас жоғалтқандығы анықталып отыр.

Сонымен, әрі қарайғы жұмыстарымызда тұракты антиденелерді түзуші клондарды М. tuberculosis УДД-мен иммунделген тышкандар лимфоциттерінен пайда болған гибридомалар арасынан ғана тандай алдық.

1Д7, 2С10 және 103 жасушалар клондары анағұрлым белсенді және тұрақты гибридомалар лимитті сұйылту әдісімен клондаудан өткізілді (5-кесте).

Кесте 5 — Моноклоналды антиденелерді түзетін гибридома жасушаларын клондау нәтижелері

Клон атауы	Субклондар саны	МКА клон – өнімдерінің саны	Субклондар белсенділігі %	Дақылдық сұйықтық титрі	Субклондар атауы
1Д7	40	27	67,5	1:16-1:128	1Д7А2
2С10	25	20	80,0	1:8-1:32	2C10F3
1G3	38	30	78,9	1:32-1:256	1G3H2

Бұл ретте бастапқы ата-аналық жасушадан гибридомдардың позитивті субклондарының шығуы 67,5%-дан 80,0%-тты құрады. Гибридомалардың алынған субклондарының ішінде микобактериалды антигендер эпитопына туыстас МКА-дің жоғары пролиферативтік белсенділігімен және өнімділігімен сипатталатын әрбір гибридомадан бір клоннан тандалып алынды. Аталмыш гибридомдардың барлық субклондарының өсінді сұйыктығының кұрамындағы моноклоналды антиденелердің титрлері 1:32 — 1:256 шамасында болды.

Гибридома штамдарының өнімділігі 3-4 тәулік бойы өсірілген гибридомалардың өсінді сұйыктығындағы моноклоналды антиденелердің концентрациясы 125 мкг/мл-ге жетті. Гибридома штаммдарын ВАLВ/с тышқандарының кұрсақ қуысында in vivo жағдайында өсіргенде олардың өнімділігі айтарлыктай жоғары болды. Өйткені, асцитті сұйыктықтағы моноклоналды антиденелердің концентрациялары 4-6 мг/мл-ге дейін жиналды, яғни асцит сұйыктығындағы антиденелер мөлшері дақылдық ортанын супернатантымен салыстырғанда 400-1600 есеге жоғарылап отыр. Сәйкесінше асцит сұйыктығындағы антиденелер титрі де артты. Гибридома жасушаларын криоконсервациялағаннан кейінгі тіршілік ету деңгейі 65-70%-ды кұрады.

Келесі зерттеуде асцит сұйыктығының моноклоналды антиденелерінің белсенділігі мен телімділігі Mycobacterium туысына жататын әр түрлі бактерия ангигендерін колдану аркылы иммунды ферменттік талдаудың жанама әдісіне анықталды. (6-кесте).

Кесте 6 — Моноклоналды антиденелердің белсенділігі мен телімділігін иммунды ферменттік талдаудың жанама әдісіне тексеру натижесі

Микобактериялардың тұтас жасушалары	МКА телімділігі
	1Д7А2	2С10F3	1G3H2
M. tuberculosis	1:204800	1:204800	1:102400
M. bovis 8	1:400	1:800	1:400
M. intracellulare	ТН	ТН	ТН
M. avium	TH	TH	TH
M. scrofulaceum	TH	TH	TH
M. kansassii	TH	TH	TH
M. fortuitum	TH	TH	TH
M. phlei	TH	TH	TH
Ескерту: TH – теріс нәтижесі

6-шы кесте мәліметтері бойынша 1Д7А2, 2С10FЗ және 1G3Н2 гибридом штаммдарының моноклоналды антиденелерінің Мусоbacterium tuberculosis жасушаларымен 1:102400-1:104800 титрде әрекеттесе, Мусоbacterium bovis жасушаларымен 1:400-1:800 титр аралығында ғана байланысқа түсіп отыр. Ал Мусоbacterium avium, іпtracellulare, scrofulaceum,, каnsassii, fortuitum және рhlеі түрлерімен әрекеттеспейтіндігі анықталды.

Басқа микобактериалды антигендерге қатысты МКА телімділігін талдауда 1Д7А2, 2С10F3 және 1G3Н2 гибридома штаммдары синтездейтін моноклоналды антиденелер Мусоbасterium bovis шт. 8. тұтас жасушасы компоненттерінің кұрамынан туыстас эпитоптар аныкталды. Мусоbacterium аvіит мен атипті микобактериялардың (М. рhіеі, М. scrofulaceum) тұтас жасушалары құрамында зерттелетін штаммдардың МКА танитын эпитоптары жоқ екендігін айта кеткен жөн. Бұл М. tuberculosis-тің тұтас жасушасына тән эпитоптарға моноклоналды антиденелердің барлықтарының да телімділігінің жоғары екендігін дәлелдейді.

Моноклоналды антиденелердің класын анықтау тышкандардың иммуноглобулиндеріне ІgМ, ІgА, IgG, ІgG2, ІgG2b (Sigma, США) қарсы монотелімді қан сарысуларын қолдану аркылы диффузиялык преципитация реакциясында (ДПР) жүзеге асырылды.

Аталмыш тәсілді жүргізу барысында монотелімді қан сарысуы мен МКА үлгілері бар шұңқыршыктарының араларында анык преципитация сызығы пайда болғанын көреміз. Қорыта келе моноклоналды антиденелердің барлық үш түрі де IgG1 класына жататындығын дәлелдеп берді.

Аффинділік байланыс константын анықтау көмегімен сандык түрде өлшенуі мүмкін. 1Д7А2 жэне 2С10FЗ штаммдарының моноклоналды антиденелерінің өз антигендерімен байланысу константасы сәйкесінше 1х10‾⁸М және 1х10^_9М болады. Ал 1G2Н2 штамының моноклоналды антиденелері жоғарыда көрсетілген антиденелермен салыстырғанда төмен аффинділікке ие болды. Алынған МКА түрлерінің иммундыхимиялык сипаттамасын зерттеу бойынша алынған мәліметтер 7-ші кестеде көрсетілген.

Кесте 7 — Гибридом штаммдары МКА иммундыхимиялык касиеттері

Гибридом штамдары	Антидене кластары және класс тармақтары	Байланысу константысы	МКА мөлшері		Антиденеге алынған ақуыздың салмағы, кДа
			дақылда мкг/мл	асцитте мг/мл
1Д7А2	IgG 1	1х10‾8	10,0	8,0	20,8
2C10F3	IgG 1	1х10_9	10,0	8,0	20,8
1G3H2	IgG 1	1*10_7	5,0	4,0	20,8

     Иммуноглобулинді препараттарының тазалығын зерттеу мақсатында аммоний сульфатымен тазартылған МКА 0,1% натрий додецилсульфаты бар 10% полиакриламидті гельдегі электрофорез әдісімен талданды.

Электрофорез нәтижесінде МКА барлык түрлері молекулалык салмақтары 60 кДа жэне 20 кДа болатын екі ақуызды фракцияға бөлінді, бұл иммуноглобулиндердің ауыр және жеңіл тізбектеріне сәйкес келеді. Электрофореграммада баска жолақтар байқалмады, бұл зерттелген моноклоналды антиденелердің тазалығын көрсетеді.

Сонымен, 1Д7А2, 2С10FЗ және 1G3H2 штамдарының түзегін МКА мен иммундыхимиялык қасиеттері жағынан антигендерге койылатын талаптарға сәйкес келеді және оларды жұкпалы ауруларды, соның ішінде туберкулез балауына арналған иммунды ферменттік тест-жүйесін әзірлеуге қажетті негізгі препарат ретінде пайдалануға болады [6].