Осы зерттеудің максаты адамдар қан сарысуындағы туберкулезге қарсы антиденелерді анықтау үшін ИФТ «жанама» және «бәсекелі» қойылымдарын ИФР-ын жүргізу шарттары мен техникасын жетілдіру болып табылады. Осыған байланысгы біз Мусоbacterium tuberculosis-тың ақуызды антигеніне антиденені табу үшін ИФТ-дың сезімталдығына физико-химиялык факторлардың (температура, иондык күш және реакциялык ортаның рН маңызы, өзара байланысу ұзактығы, концентрациялық катынасы) әсерін зерттедік.

Туберкулез микобактерияларына телімді антиденелерді ИФТ «жанама» қойылымымен анықтау сызбасы негізгі 5 кезеңнен тұрады:

1 – ші кезеңде -антиген катты фазага адсорбцияланады.

2 – ші кезеңде — зерттеуге алынған материал кұрамындағы антиденелер катты фазаға адсорбцияланған антигенмен спецификалық байланысады да «антиген+антидене» иммунды кешенін кұрайды.

3-ші кезең — ферментпен танбаланған антиденелер (конъюгат) «антиген+ антидене» кешенімен телімді байланысып, «антиген+антидене+конъюгат» иммунды кешеніні пайда болады.

4-ші кезең — субстрат ерітіндісінің көмегімен «антиген+антидене+ конъюгат» иммунды кешенін анықтау. Бұл кезенде, реакция нәтижесі оң болған жағдайда субстрат сұйықтығының түсінің өзгеруі байқалады.

5-ші кезең — реакция нәтижесін немесе ферменттік реакция өнімдерінің оптикалық тығыздығын спектрофотометрдің көмегі арқылы бағалау.

ИФТ-дың «бәсекелі» койылымында антиген қатты фазаға адсорбцияланған моноклоналды антиденелермен байланысып реакция кезеңі бір сатыға артады.

Әрбір кезеңнің оңтайлы параметрлерін анықтау үшін ИФТ-ды бес рет қайталап жүргіздік.

Зерттеу нәтижелері бойынша ИФТ-дың жеткілікті сезімталдығын камтамасыз ететін Мусоbacterium tuberculosis-тің ақуызды антигенінің оңтайлы концентрациясы 5-10 мкг/мл-ді көрсетті. Антигендердің концентрациясын әрі қарай жоғарылату реакцияның телімсіз боялуының артуы мен препараттарды ұтымсыз жұмсауға алып келді. Алынған нәтижелерді талдау барысында колданылған барлық ақуызды антигендердің ИФТ-ға қажетті қатты фазада жақсы сорбцияланатындыгын дәлелдейді.

Біз иммунды ферментті талдауда бірінші антидене мен антиген ретінде қолданылатын Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің ақуызды антигеніне телімді моноклоналды антиденелердің оңтайлы концентрациясын анықтау үшін бірқатар тәжірибе жүргіздік. Моноклоналды антиденелердің оңтайлы концентрациясын анықтау барысында моноклоналды антиденелердің концентрациясы 10 мкг/мл болған жағдайда полистиролды планшет шұңқыршықтарының белсенді орталыктарының толық инактивацияланатындығы айкындалды. Моноклоналды антиденелердің анағұрлым жоғары концентрациясын колдану препараттарды орынсыз жұмсалуына әкеліп соқтырды. Моноклоналды антиденелерді катты фазамен толық байланыстыру үрдісі 37°С температурада 1 сағатта аяқталды. Сонымен катар, сенсибилизацияны 4°С температурада 16 сағат бойы жүргізген жағдайда да жаксы нәтижелерге кол жеткіздік. Түрлі буферлі ерітінділердің рН-ның мәнін МКА қатты фаза беткейінде адсорбциялануына, «МКА+антиген+телімді антидене+конъюгат» кешенінің пайда болу реакциясына әсері түрлі иондық күш (2,0-ден 10,0-ға дейінгі) диапазоны зерттелінді. Буферлік жүйе ретінде зерттеуге рН 2.0 жэне 4,0 болатын натрий-ацетатты ерітіндісі, рН 7,0 және 7,4 болатын буферленген физиологиялық ерітінді, рН 9,5 және 10,0 болатын натрий-карбонатты буфері алынды. Тәжірибелер нәтижелері бойынша, ИФТ-да реакциялық сұйықтықтың боялу карқындылығы буферлі ерітінділердің рН мәніне тікелей тәуелді, яғни олардың рН-ы 7,0-10,0 аралығында болған жағдайда жоғары көрсеткіштерге қол жеткіздік. ИФТ қоюда антиген мен зерттелетін антидене арасындағы, сонымен қатар «антиген-антидене» иммунды кешені мен иммунды пероксидазалы конъюгат арасындағы тепе-тендік айтарлыкқтай маңызды орын алатындығы белгілі. Катты фаза беткейіне адсорбцияланған антиген мен МКА байланысу кинетикасын бағалау +37°С температурада 30 минут, 1, 2, 3 және 4 сағат аралығында жүрг ізілді.

Антиген-антидене реакциясындағы тепе-теңдік 2 сағат инкубацияланғаннан кейін пайда болып, оларды оптикалык тығыздығы 0,980- 1.044 о.б. кұрады. Экстинцияның жоғарылауы катты фаза беткейімен ақуыздың телімсіз байланысуының арқасында «фондық» көрсеткіштің 20-40% артуына алып келді.

Түрге қарсы пероксидазалық конъюгат пен антиген+антидене кешенінін байланысын бағалау нәтижесінде жүйелер арасындағы тепе-теңдік +37^°С температурада 1 сағат бойы инкубациялау барысында байқалды. Ал, реакциялык сұйыктықтың оптикалық тығыздығы 0,930-0,950 о.б. шамасында ауытқып отырды. Негативті бақылау сарысуын қолданған жағдайда бұл көрсеткіш 0,370-0,390 о.б. шамасында болды. 1 сағаттан артық инкубациялау бақылауга койылған сынаманың оптикалық тығыздық шамасының 30-35%-ға артып «фондық» боялудың өсуіне алып келді.

Біз антитүрлік конъюгаттардың (флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) «Сигма» шығарған (ФРГ) «антиген-антидене» кешенімен байланысу кинетикасына әсер ету ұзақтығы мен тәртібін зерттедік (8-кесте).

 

Кесте 8 — ФИТЦ-пен МКА-ді конъюгациялау шарттары

Клон атауы	МКА 1 мг-ғы ФИТЦ мөлшері
	5 – 10 мкг	20 – 25 мкг	30 – 40 мкг	40 – 45 мкг
1Д7	Өте әлсіз жарқырау	Әлсіз жарқырау	Біркелкі жарқырау	Телімсіз жарқырау
2С10	Өте әлсіз жарқырау	Әлсіз жарқырау	Біркелкі жарқырау	Телімсіз жарқырау
1G3	Өте әлсіз жарқырау	Әлсіз жарқырау	Біркелкі жарқырау	Телімсіз жарқырау

 

Кестеден көргеніміздей 1 мг МКА-де ФИТЦ-тің анағұрлым үйлесімді мөлшері 30-40 мкг кұрады. Экспозициянын жоғарылауы ФИТЦ бояғышы коспаларының болуына байланысты «фондық» көрсеткішінің 40-60%-ғы артатындығы байкалды.

Иммунды флюоресцентті конъюгатты қолдану барысында телімсіз байланысудың (боялу) анағұрлым төмен дәрежесі мен флюоресценция максималды жұмыс сұйылтымы 1:50-ге жетті.

Иммунды флюоресцентті реакциясының тікелей әдісін қажетті жағынды микобактериядан заттық шынысының бетінде дайындалды.

Туберкулезге шалдыққан науқастардан алынған биологиялық материалдың барлығы 10 сынамасы «бэсекелі» ИФТ және ИФР әдістерімен зерттелді. Бакылау ретінде Циль-Нильсен әдісімен боялған жағындылар микроскопиясы мен тығыз қоректік орталарда өсірілген Мусоbacterium tuberculosis культурасы анықталды (9-кесте).

 

Кесте 9 — Туберкулезге алынған сынамаларды зерттеу нәтижелері

Сынамалар	Зерттеу әдістері
	Бактериоскопия	Бактериология	ИФР	“бәсекелі” ИФТ
1	+	+	+	+
2	+	+	+	+
3	+	+	+	+
4	+	+	+	+
5	+	+	+	+
6	+	+	+	+
7	+	+	+	+
8	+	+	+	+
9	+	+	+	+
Теріс бақылау	-	-	-	-
Ескерту: (+) – оң реакция, (-) – теріс реакция

 

     Кесте мэліметтері бойынша иммунды флюоресцентті реакциясы мен иммунды ферментті талдаудың бәсекелесу түрі бактериоскопия мен бактериология нәтижелерімен сәйкес келетіндігі айқындалып отыр.

Моноклоналды антиденелерді қолдана отыра жүргізілген ИФТ және ИФР әдістері адам туберкулезінің балауына кететін уакыттың едәуір қысқаруына мүмкіндік береді.

     Туберкулезге шалдыкқан адамдардын қан сарысуындағы туберкулезге қарсы антиденелерді анықтау

Жұмыс барысында 120 туберкулезге шалдыққан адамдардың кан сарысуы және 80 дені сау адамдардың қан сарысуы зерттелді. Туберкулезге қарсы түзілген антиденелерді анықтау иммунды ферментті талдаудың бәсекелестік қойылымымен жүзеге асырдық. Бұл әдістің ерекшелігі мынада: қатты фазаға бекітілген антигенге моноклоналды антиденелер мен науқас адамдардың кан сарысуындағы телімді антиденелердің отыруына бәсекелесуінде.

     М. tuberculosis -тің ақуызды антигенінің концентрациясы 10 мкг/мл тең 96- шұнкыршықты полистирольді планшетіне 25 мкл отырғыздык. Антиген сенсибилизацияланбаған планшетгің бос аймактарын 1%-ды сиыр сарысуы альбуминімен бекіттік. Туберкулезге шалдыққан адамдардың қан сарысуын және дені сау (донорлардың) адамдардың қан сарысуларын БСА, ФТЕ-Т ертіндісінде 1:5, 1:25 және 1:125 мөлшерде сұйылтып, моноклоналды антиденелердің глобулинді фракциясымен (10 мкг/мл) бірдей деңгейде араластырдық. Содан кейін осы сұйықтықты үш қатардан планшетке отырғызып 4°С-де 12 сағ. инкубацияладық. Бақылау ретінде концентрациясы 5 мкг/мл моноклоналды антидене + планшетке отырғызылған антигеннің тікелей байланысу реакциясы колданылды. Конъюгат ретінде тышканның иммуноглобулинімен адам иммуноглобулиніне қарсы алынған және пероксидазамен таңбаланған коянның антиденелері қолданылды. Хромогенді субстрат ретінде ортофенилендиамин пайдаланылды. Реакцияны 1,25 М Н28О4 ерітіндісі көмегімен токтаттық. Талдау нәтижесін толқын ұзындығы 492 нм болатын вертикалды жарық ағыны бар спектрофотометр (Dynateck, Германия) көмегімен шығардық. Қан сарысуы кұрамындағы антиденелердің болуын тікелей реакция нәтижесімен салыстыра отыра (%), яғни моноклоналды антиденелер және антигенге байланысты тұжырымдадық. Егер реакция интенсивтілігі бақылаудағы тікелей реакция сынамадан 50% төмен болса, онда сынама нәтижесін он деп санаймыз.

Сау адамдар мен туберкулезге шалдыққан адамдардың кан сарысуындағы туберкулезге карсы антиденелерді анықтаудың бәсекелестік талдауы 10-шы кестеде көрсетілген.

 

Кесте 10 — М tuberculosis-тің ақуызды антигенімен МКА мен адамның қан сарысуының ингибициясы бойынша тәжірибе реакциясын нәтижесінің мысалы

Қан сарысу	Қан сарысу сұйылтымы	Трипликаттар			Ортақ арифметикалық саны	Байланысу, %	Ингибициясы, %
Науқас	1:5	0,217	0,240	0,223	0,226	33,7	66
	1:25	0,279	0,269	0,275	0,274	40,9	59
	1:125	0,373	0,398	0,351	0,374	55,9	44
Сау	1:5	0,650	0,623	0,667	0,646	96,5	3,4
	1:25	0,622	0,635	0,657	0,638	95,3	4,6
	1:125	0,654	0,678	0,690	0,667	99,7	0,2
Тікелей реакциясы (Антиген + МКА)		0,678	0,658	0,672	0,669	100

 

Тікелей реакциядағы трипликат тығыздығының орташа көрсеткішін (100%) деп қабылдап, содан кейін трипликаттардың орташа көрсеткіштеріне сүйеніп тәжірибенін пайыздык байланысуын санап шығардык, ал тікелей реакция мен тәжірибе реакциясының айырмашылықтарын ингибиция нәтижесі ретінде қабылдадық.

Статистикалык өндеуді Стьюдент өлшемі бойынша жүргіздік (1:25 сұйылтымында алынған қан сарысуы нәтижелерін колдандык, 11-кесте).

 

Кесте 11 — М.tuberculosis-тің ақуызды антигенімен МКА туберкулезге қарсы антиденемен ингибиция көрсеткіші

Көрсеткіштері	Туберкулезбен ауыратын науқас n=120	Сау адамдар n=80
Ингибиция пайызы	М-42,1 М-1,8	М-17,1 М-1,4
Ауру адамдармен сау адамдардың көрсеткішін салыстыру кезіндегі статистикалық айырмашылығы анық (P<0,001).

Кестеде көрсетілгендей, туберкулезге шалдыққан адамдар мен сау адамдардың ингибициясының пайыздык айырмашылығы статистикалық айқындалды.

Пайыздық ингибицияның көрсеткіші 50%-ға жетсе немесе одан жоғары болған жағдайда тәжірибенің нәтижесін оң деп санадық (ауру адамдар мен сау адамдардың айқын айырмашылыгының көрсеткіштері 50%, сондай ақ тікелей реакция ингибициясының көрсеткіші одан аса түсті).

120 туберкулезге шалдыққан адамның ішінен 74 наукастың қан сарысуы сұйылтымының 1:5 және 1:25 болғанда және 80 сау донордын ішінен 4 адам он нәтиже (МКА мен ингибициясы) көрсетті. Ауру адамдардың кан сарысулары және сау адамдардын қан сарысулары 1:125 сұйылтымында әдеттегідей нәтиже 0-35% тура реакция ингибициясын берді.

Сонымен, алынған нәтижелер сау адамдар мен туберкулезге шалдыққан адамдардың зерттеліп отырған моноклоналды антиденелер бағытталған, салмағы 20,8 кДа антигендік детерминантасына елеулі айырмашылықтары бар екенін дәлелдейді. Туберкулезге шалдыққан адамдардың оң нәтижелі реакциялардың аз көлемі әдеттегідей жағдай, өйткені адамдарда ауру тудыратын адамдық вирулентті микобактерилерінде, сөзсіз, баска да эмбебап антигендік детерминанталары болады.

Сау адамдар реакциясының оң нәтиже беруін халык арасында инфицирленген адамдардың болуымен және ұксас антигендік детерминанттар БЦЖ микобактериінде болуымен түсіндіріледі.

Моноклоналды антиденелер негізінде ИФТ «жанама» тәсілін ИФТ-ың «бәсекелі» тәсілімен салыстырмалы талдауы өткізілді (12-кесте)

Кесте 12 — МКА негізінде «бәсекелі» ИФТ-дың диагностикалық кұндылығын анықтау нәтижесі

Зерттеу тобы	Сынама саны	Оң нәтиже көрсеткен сынама саны
		Бактериоскопия		Бактериология		ИФТ “жанама”		ИФТ “бәсекелі”
		Оң нәтиже	%	Оң нәтиже	%	Оң нәтиже	%	Оң нәтиже	%
Науқас	120	70	58,3	74	78,3	87	72,5	74	78,3
Сау	80	2	2,5	2	2,5	15	12,5	4	5

12-ші кестеде көрсетілген, туберкулезді зерттеуде бір уакытта ИФТ екі әдіспен («жанама» ИФТ және «бәсекелі» ИФТ) және бактериологиялық зерттеулерде 120 оң және 80 теріс сынама жасалынды. 120 сынаманың ішінен «бәсекелі» ИФТ-да 74-і оң (78,3%), ал «жанама» ИФТ-да 87-і он (72,5%) нәтиже көрсетті. 80 теріс сынаманын ішінде «бәсекелі» ИФТ-да 4-і (5%), ал «жанама» ИФТ-да 15-і (12,5%) оң нәтиже көрсетті.

120 он үлгілерде «бәсекелі» ИФТ-дың бактериология әдісімен нәтижелердің сәйкес келуі 100% тен болды, ал ИФТ-дың бактериоскопия әдісімен нәтижелердің сәйкес келуі 94,5% құрады. Ал «жанама» ИФТ мен бактериологияның нәтижелерінің бірдей болу пайызы 85%, ал бактериоскопиямен 80%.

Зерттеу нәтижелері «бәсекелі» ИФТ әдістің телімділігі «жанама» ИФТ-ға карағанда жоғары екенін көрсетті.

Сонымен алынған моноклоналды антиденелер адам туберкулездің серологиялык балауында колдануға жарамды болып табылды. Осы антиденелер көмегімен қан сарысу кұрамындағы туберкулезге карсы антиденелерді ИФТ- дың «бәсекелі» қойылымымен толығырак анықтауға мүмкіндік береді [8].

ҚОРЫТЫНДЫ

     Атқарыған зерттеу жұмыстарының нәтижесінде Мусоbacterium tuberculosis-тің ақуызды антигеніне телімді моноклоналды антиденелердің негізінде әзірленген иммунды ферменттік талдаудың бәсекелі нұсқасымен адам туберкулезін тез арада анықтау балауында косымша әдіс ретінде колдануға болатындығы анықталды.

Курстық жұмыстың алынған нәтижелері бойынша мынадай қорытындылар шығарылды:

1. О. Westphal бойынша сулы-фенолды әдісімен және ультрадыбысты дезинтеграция арқылы зерттеуге арналған микобактериялардың липополисахаридті және ақуызды антигендері алынды. ЛПС шығуы микроорганизм түріне және колданылған микробтың салмағына тәуелді 2,2-3,5 мг немесе 0,018-0,0088%-ды кұрады, сонымен катар ақуызды антиген 31,25-62,5 мг немесе 0,125-0,32% мөлшерде алынды.
2. Иммундеудің екі апталык сызбасын колдана отыра егілген ВАLВ/с тышқандарының ағзаларында микобактерия антигендеріне телімді моноклоналды антиденелер қаркынды синтезделіп олардын ИФТ «жанама» койылымындағы титрлері 1:12800-1:25600-ге жетті.
3. Гибридомдық технология әдісімен 3 штам алынды. 1Д7А2, 2С10F3 және 1G3H2 моноклоналды антиделерді тұрақты синтездейтін гибридоманын ІgG1 класс тармағына жататын және байланысу константасы 1 х 10-⁷ М-дан 1 х 10 -⁹ М-га тең болғандығы анықталды.
4. Гибридома штамдарын синтездік тышкандардың кұрсақ қуысында өсіру барысында алынған асцит сұйыктығындағы МКА мөлшері 4-8 мг/мл кұрады. ИФТ моноклоналды антиденелер титрі өсінді салыстырғанда 800-1600 есеге жоғарылады. Гибридома штамдарының моноклоналды антиденелері ИФТ М. tuberculosis-ке телімділігімен сипатталды, ягни М аviит тұтас жасушаларымен және М. рhlеі, М. scrofulaceum атипиялык микобактериялардың тұтас жасушаларымен байланыспайды.
5. Бәсекелі ИФТ қойылымында 120 туберкулезге шалдықкан адамның ішінен 74 науқастың қан сарысуы сұйылтымының 1:5 және 1:25 болғанда және 80 сау донордың ішінен 4 адам оң нәтиже (МКА мен ингибициясы) көрсетті.
6. 120 он үлгілерде «бәсекелі» ИФТ-дың бактериология әдісімен нәтижелердің сәйкес келуі 100% тең болды, ал ИФТ-дың бактериоскопия әдісімен нәтижелердің сәйкес келуі 94,5% кұрады. Ал «жанама» ИФТ мен бактериологияның нәтижелерінің бірдей болу пайызы 85%, ал бактериоскопиямен 80%.

Жұмыста койылган міндеттер толықтай орындалды. Моноклоналды антиденелер негізіндегі ИФТ-дың бәсекелесу нұскасын ғылыми-зерттеу зертханаларында және медициналык мекемелерде адам туберкулезін балауға арналған қосымша серологиялық әдіс ретінде колдануға ұсынылады.

Осы салада қол жеткізілген жоғары жетістіктермен салыстыра отыра алынған мәліметтерді талдай келе диссертациялык жұмыстын биохимиялык (электрофорез, хроматография), серологиялық (РИД, ИФТ), статистикалық, биотехнологиялык (гибридомдык технология) зерттеу әдістерін колдана отырып, жұмыстың жоғары гылыми-техникалык деңгейде орындалғанын атап өту кажет, яғни моноклоналды антиденелер негізінде косымша диагностикалык тест-жүйелерді әзірлеу қазіргі заман талаптарына сәйкес келеді.

Алынған нәтижелердің талдауы көрсеткендей, берілген жұмыста қойылған міндеттер толығымен орындалды.

Тәжірибелер 2006-2009 жылдар аралығында зертханалык жағдайда Қазакстан Республикасы Ұлттык биотехнология орталығы иммундыбиотехнология және иммундыхимия зертханасында қазіргі заманға сай биотехнологиялык зерттеу әдістерін колдана отырып орындалды және барлық талаптарга сәйкес келеді.

ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР

1. Ахаева А.А., Муканов К.К., Бакирова Г.А. Получение гибридом продуцентов — моноклональных антител к возбудителю Mycomacterium tuberculosis // Республиканская научно-теоретическая конференция «Сейфуллинские чтения4». — Астана, 2008. — С. 82.
2. Бакирова Г.А., Ахаева А.А., Муканов К.К., Акибеков О.С., Жунусова У.К. Получение микобактериальных антигенов для постановки иммуноферментного анализа // «Сейфуллинские чтения-3», посвященные 50- летию основания КазГАТУ им. С. Сейфуллина. — Астана, 2007. — С. 141-142.
3. Муканов К.К., Бакирова Г.А., Ахаева А.А., Булашев А.К., Жунусова У.К,, Акишева А.С. Получение моноклональных антител к Мусоbасtеrіит tuberculosis // «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и преспективы инновационного развития»: Международная научно-практическая конференция, посвященная 50-летию Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности. — Алматы. 2008, 19-21 мая. — С. 298-300.
4. Ахаева А.А., Муканов К.К., Бакирова Г.А., Шенжанов К.Т., Жунусова У.К. Получение и изучение антигенных свойств микобактериальных антигенов // Журнал «Биотехнология. Теория и практика». — Астана, 2008. — №2. — С. 47- 51.
5. Бакирова Г.А., Муканов К.К., Шенжанов К.Т., Ахаева А.А., Сарина Н.И., Жунусова У.К. Совершенствование методов диагностики туберкулеза у людей с использованием моноклональных антител // Материалы 1- ой международной конференциии «АСТАНА-БИОТЕХ 2008». Астана, 2008. — С. 46.
6. Ахаева А.Ә. Мусоbacterium tиberculosis қоздырғышынан алынған гибридома штамдарынан түзілетін моноклоналды антиденелердің қасиеттерін анықтау // «Биотехнология. Теория және практика» журналы. — Астана, 2009. — №1. — Б. 101-106.
7. Ахаева А.А., Бакирова Г.А., Муканов К.К., Мукантаев К.Н., Раманкулов Е.М., Акибеков О.С. Изучение морфолого-культуральных иммунохимических свойств моноклональных антите.п к Мусоbасtеrіит tuberculosis // Научный журнал Павлодарского государственного университета им. С. Торайгырова «Вестник ПГУ». — Павлодар, 2009. — С. 37-45.
8. Авторское свидетельство №22178, КZ, А 22178 С12N 5/00, «Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. — продуцент моноклональных антител к белковому антигену Мусоbacterium tuberculosis // Ахаева А.А., Бакирова Г.А., Раманкулов Е.М., Муканов К.К., Шенжанов К.Т.- Опубл. бюлл. №1 от 15.01.2010.