Эукариоттарда ген экспрессиясының регуляциясында маңызды биологиялық рөлді РНК интерференция молекулалық үрдісі атқарады (RNA interference (RNAi)). RNAi бұрыннан өсімдіктерде геннің пост транскрипциондық тыныштығы (post-transcriptional gene silencing(PTGS)) деген атпен белгілі және ол тірі ағзалардағы ген экспрессиясының реттелуінде негізгі рөлді ойнайтын молекулалық механизм болып табылады. RNAi жоғары өсімдіктерде табиғи молекулалық тұрақтылық негізі. Сонымен қатар ол вирусты таңдаулы түрде анықтап, оның кезекті деградацияға ұшырауын қамтамасыз етеді.

RNAi-дың бастапқы механизмі, ұзын қос тізбекті РНК молекуласының (dsRNA) синтезі  болып табылады (1). Келесі RNAi-дың функционалды қадамы Dicer (Dicer-like DCL) -(РНКаза III тобының мүшелері)  ферментінің әсері. Ол өз кезегінде  өзіне қысқа РНК молекуласын интерференциялайтын (short interfering RNAs(siRNAs)) және микро РНҚ-ның (microRNAs) 3′ жабысқақ ұшы 20-30 нуклеотидтің) әрекетін катализдейді (2). Бұл шағын РНК молекулалары вирустық РНК-ның ұзын репликативті формаларының, және де трансген мен транспозондардың, энзиматикалық гидролиз нәтижесінде түзілуі мүмкін (3). Өсімдіктің вирусы жағдайында, siRNAs тікелей вирустық геномнан түзілуі мүмкін, бірақ соңғы дәлелдеулер, сонымен қатар, РНК тәуелді РНК полимеразаның (RNA dependent RNA polymerases) қатыматынын анықтады.

Өсімдіктерде жүргізілген соңғы зерттеулерде көрсетілгендей, siRNAs-ның ферменттік метилденуі бұл молекулалық олигоурдилация үрдісінен оның келесі деградациялануына дейінгі оның тұрақтылығын сақтауда негізгі рөль атқарады (4). siRNAs-тың метилденуі 3′ ұшында болады және бұл ферментативтік модификация метил трансферазамен HUA ENHANCER1 (HEN1) катализденеді (5,6).

Келесі кезекте RNAi, қос тізбекті siRNAs молекулалары ажырайды және тізбектің біреуі көп компонентті эффекторлы комплекске орналасады (RNA-induced silencing complex (RISC)). Ерекше транскриптің оның кезекті ферментативті гидролизі немесе трансляциондық репрессияның комплементарлы нуклеотидтер тізбегін табу үшін siRNA RISC –ке қосылып «іздеуші матрица» қызметін атқарады (3). siRNA нуклеотиді мен берілген РНК арасындағы комплементарлы қосылу қажетті мақсатты табуда тиімділікпен қамтамасыз етеді. Тәжірибелік мәліметтер, siRNAs және Argonaute(AGO) туқымдасының ақуыздары RISC–ң универсальді компоненттері болып табылатынын айтуға болатынын көрсетіп отыр (7). AGO ақуыздары ерекше консерванты PAZ және PIWI деп аталатын доменнің болуымен сипатталады (8). Құрылымдық зерттеулер, домен PAZ AGO –да тікелей siRNA –мен өзара әрекеттесетінін дәлелдеді (9). Бұған қоса PAZ домен siRNAs – тің  3′ ұшымен өзара әрекеттесетіні де белгілі болды. Домен PIWI AGO ақуызында негізгі каталитикалық орталық болып табылады, өйткені ол эндонуклеаздық белсенділікке ие (7).

RNAi әрекетіне қарсы жауап ретінде вирустар өсімдіктердің иммундық тұрақтылығының молекулалық механизміне қарсы ерекше стратегия тапты. RNAi-ға қарсы ең тиімді және қолданбалы контрмера болып молекулалық –иммундық механизмінің вирустық супрессиясы болып табылады. Мысалы, көптеген вирустар RNAi-ды тиімді тоқтатып қоя алатын ерекше ақуыз супрессорларды кодтайды (viral supressors of RNAi(VSR)). Өсімдіктердің қорғаныс жүйесіне қарсы тұру үшін вирустық VSR экспрессиясы себепті болжамдар қозғауда. Ол болжамдар RNAi-дың бастапқы қызметі өсімдіктердегі патогенге қарсы тұру болып табылады (10).

Қазіргі көптеген вирустық ақуыздар VSR деген атпен белгілі, себебі олар бастапқыдан патогендік немесе вируленттіктің факторы ретінде белгілі болды, өйткені олардың экспрессиясы вирустық аурудың түзілуімен белгілер амплитудасын анықтайды (11). Көбіне бұл ақуыздардың экспрессиясы вирустық репликациялардың негіздеуші факторы емес. Бірақ вирустық супрессорлар тиімді аккумуляция және инфекция барысында вирустардың таралуы үшін қажет (12). Қазіргі кезде супрессорлық белсенділікке ие көптеген вирустық ақуыздар табылды. Бірақ олардың жұмысының биохимиялық механизмі әдебиеттерде жақын арада пайда болды. Соңғы молекулалық, биохимиялық және құрылымдық әр түрлі VSR зерттеулер RNAi супрессиясының механизмін толық қарауға мүмкіндік берді. Барлық вирустық супрессорлардың ортақ қасиеті болып RNAi-дың әр түрлі кезеңінде оның қорғаныштық жүйесіне қарсы әсер ету болып табылады. Бұл қарсылық әрекеті вирус пен өсімдік арасында күрделі және қиын «эволюциялық күрестің» интенсивті мысалы бола алады (13). Вирустық супрессор мен өсімдіктердің RNAi механизмі арасындағы коэволюция, сонымен қатар, өсімдіктің қорғаныс жүйесіне вирустың бейімделуінің қиныдылығын дәлелдеп отыр.

Қазіргі шолудың мақсаты молекулалық және биохимиялық RNAi супрессиясының өсімдік вирустарымен байланысын жаңа ғылыми мәліметтерді негізге ала отырып, жалпылау болып табылады.

 

RNAi вирустық супрессорларының биохимиялық қасиеттері

Potyvirus HC-Pro

Potyviridae тұқымдасының вирусы HC-Pro (helper component-proteinase) супрессорын кодтайды, ол вирустағы мультифункционалды ақуыздың классикалық мысалы. Ол осы вирус тұқымдасының инфицирленген ағзада жүйелі таралуына жауапты. HC-Pro қатысатын көптеген биологиялық үрдістер: вирустық репликация, вирустық полиақуыздық жүйелі және жасуша аралық қозғалысы мен ақуыздың еруі (14). Сонымен қатар, HC-Pro негізгі биологиялық қызметі болып RNAi супрессиясына қатысуы болып табылады. HC-Pro  RNAi супрессиясына қатысатыны туралы алғашқы зерттеулер (P1/HC-Pro сиквенсті кодтайтын) Tobacco etch virus (TEV) геномының 5′ –ұшы сегментін экспрессиялайтын трансгенді өсімдіктерде басқа вирустармен жұқтырғанда аурудың белгілерінің жоғарылауынан байқалды (15). Келесі тәуелсіз зерттеулер ақуыздың инфицирленген өсімдіктерде RNAi супрессиясының негізгі факторы екендігін көрсетті (15). Келесі вирустық мутациондық анализі, HC-Pro орталық аймағы ақуыздың супрессорлық әрекеті үшін қажет екенін көрсетті, осы уақытта бұл функция үшін оның N –ұшы міндетті емес (16). Маңыздысы, HC-Pro  өсімдіктерде RNAi эндогендік супрессоры болып табылатынын rgsCaM ақуызымен өзара әсерлесетіндігі (16).

HC-Pro   биохимиялық зерттеулері, оның димерлер мен мультимерлерді қалыптастыру қабілеті RNAi супрессор ретінде функциясына критикалық екендігін көрсетті (15). Сонымен қатар, HC-Pro  супрессордың функциясы siRNA тұрақтылығының төмендеуімен байланысты болуы мүмкін, себебі ақуыздың трансгендік экспресссиясы  5′ –ұшының siRNAs 21 нт вирустың модификациясының төмендеуіне әкеледі (17). Және де HC-Pro  mi/siRNA функционалды метилденуі (17) мен ds siRNA байланысуына кедергі жасайды (33). Жақындағы зерттеулер, FRNK аймағының қызметтік рөлін тапты, яғни HC-Pro   құрылымында ақуызбен siRNA байланысуы. Және де бұл қызмет miRNAs селективті байланысуы мен вирустық аурудың белгілерінің амплитуда деңгейімен байланысы белгілі болды (16).

 

Cucumovirus 2b

HC-Pro  секілді, Cucumovirus тұқымдасымен кодталатын ақуыз 2b RNAi супрессорның алғашқы табылғандардың бірі. GFP трансгенімен тәжірибелерде  2b экспрессиясы RNAi қарсы әсер ететіні көрсетілді (17). Кейінгі, темекінің суспензиялық жасушамен және бүтін  өсімдіктермен жүргізілген зерттеулер 2b  құрылымында ядро жасушасында ақуыздың орналасуына жауапты ядролық  сигнал локализациясына(nuclear localization signal (NLS) бай аргининді тапты. NLS мутация ақуыздың супрессорлық белсенділігін төмендетіп,супрессор функциясын іске асыру үшін 2b ядролық локализациясының қажеттілігін көрсетеді (18). Кейінгі зерттеулер, 2b RNAi жасушаның сигналының жасушааралық таралуын ұстайтын s және ядрода ДНК метильдену үрдісін ингибирлейтінін дәлелдеді (18). Қызықтысы, 2b салицил қышқылының көмегімен өсімдіктердің вирусқа төзу механизмін тоқтатуға болатыны анықталды. Бірақ, бұл жағдайдың ақуыздың супрессорлық  функциясына қандай қатысы бар екені әзір белгісіз (19).

Соңғы зерттеулер siRNAs типінің  2b экспрессия генерациясы DCL4, DCL2, DCL3 ферментерімен катализденетін 21, 22 және 24 нт жиналуын төмендетеді (ә3).

Соңғы зерттеулер, басқа көптеген белгілі вирустардың супрессорларға қарағанда, 2b тікелей AGO1 in vitro және in vivo жағдайында RISC комплексінің каталитикалық орталығы болып табылатын  өзара әсерлесетінін дәлелдеді (20). Сонымен қатар, 2b мен  AGO1 арасында өзара әсерлесу РНК-ның нуклеаздық комплекстің ферментативті гидролизінің ерекше ингибирленуіне алып келеді.

Вирустық супрессорларға қатысты соңғы жаңа молекулалық  және биохимиялық зерттеулер RNAi супрессиясының вирустық стратегиясы туралы біздің білімімізді кеңейтуге септігін тигізді. Вирустық супрессорлар RNAi –мен әр түрлі кезеңінде бұл қорғаныс жүйесімен күресуге қажет кең спектрлі биохимиялық қасиеттерге ие.

Вирустық супрессорлардың келесі толық молекулалық, биохимиялық және құрылымдық зерттеулер ағзаның қорғаныш жүйесі мен вирус арасында молекулалық қарым –қатынас механизмін толық зерттеу үшін қажет. Уақыт өткен сайын вирустық патогенге төзімді өсімдіктерді шығарудың тиімді жолын табу үшін бұл саладағы зерттеулердің маңызы өте зор.

 

Қолданылған әдебиеттер:

1.  Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998)

Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

2.  Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K. D., Carrington, J. C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313, 68-71.

3.   Ding, S. W., and Voinnet, O. (2007) Antiviral immunity directed by small RNAs. Cell 130, 413-426.

4.  Diaz-Pendon, J. A., and Ding, S. W. (2008) Direct and indirect roles of viral suppressors of RNA silencing in pa thogenesis. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 303-326.

5.  Moissiard, G., Parizotto, E. A., Himber, C., and Voinnet, O. (2007) Transitivity in Arabidopsis can be primed, requires the redundant action of the antiviral Dicer-like 4 and Dicer-like 2, and is compromised by viral-encoded suppressor proteins. RNA 13, 1268-1278.

6.  Vaistij, F. E., and Jones, L. (2009) Compromised virus-induced gene silencing in RDR6-deficient plants. Plant Physiol. 149, 1399-1407.

7.  Li, J., Yang, Z., Yu, B., Liu, J., and Chen, X. (2005) Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3′-end uridylation activity in Arabidopsis. Curr. Biol. 15, 1501-1507.

8.  Park, W., Li, J., Song, R., Messing, J., and Chen, X. (2002) CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 12, 1484-1495.

9.  Yang, Z., Vilkaitis, G., Yu, B., Klimasauskas, S., and Chen, X. (2007) Approaches for studying microRNA and small interfering RNA methylation in vitro and in vivo. Methods Enzymol. 427, 139-154.

10.  Rand, T. A., Ginalski, K., Grishin, N. V., and Wang, X. (2004) Biochemical identification of Argonaute 2 as the sole protein required for RNA-induced silencing complex activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 14385-14389.

11.  Cerutti, L., Mian, N., and Bateman, A. (2000) Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain. Trends Biochem. Sci. 25, 481-482.

12.  Song, J. J., Liu, J., Tolia, N. H., Schneiderman, J., Smith, S. K., Martienssen, R. A., et al. (2003) The crystal structure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif in RNAi effector complexes. Nat. Struct. Biol. 10, 1026-1032.

13.  Song, J. J., Smith, S. K., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305, 1434-1437.

14.  Li, F., and Ding, S. W. (2006) Virus counterdefense: diverse strategies for evading the RNA-silencing immunity. Annu. Rev. Microbiol. 60, 503-531.

15.  Brigneti, G., Voinnet, O., Li, W. X., Ji, L. H., Ding, S. W., and Baulcombe, D. C. (1998) Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17, 6739-6746.

16.  Scholthof, H. B. (2005) Plant virus transport: motions of functional equivalence. Trends Plant Sci. 10, 376-382.

17.  Scholthof, H. B. (2007) Heterologous expression of viral RNA interference suppressors: RISC management. Plant Physiol. 145, 1110-1117.

18.  Cronin, S., Verchot, J., Haldeman-Cahill, R., Schaad, M. C., and Carrington, J. C. (1995) Long-distance movement factor: a transport function of the potyvirus helper component proteinase. Plant Cell 7, 549-559.